新品上市 l 熱敏UDG/UNG

發(fā)布時(shí)間：2022-08-09 發(fā)布人：

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熱敏UDG/UNG——高效去除擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染

　　在核酸檢測(cè)、司法鑒定、食品檢測(cè)等分子診斷實(shí)驗(yàn)室中，經(jīng)常使用PCR或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP) 等技術(shù)大量擴(kuò)增同類樣品，由擴(kuò)增產(chǎn)物散逸形成的氣溶膠所導(dǎo)致的PCR假陽性問題帶來很大困擾。使用尿嘧啶-DNA糖基化酶 (Uracil-DNA Glycocasylase) 去除擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染是目前較為安全和有效的方法。

UDG作用原理

　　尿嘧啶-DNA糖基化酶 (Uracil-DNA Glycocasylase)，簡(jiǎn)稱UDG或UNG。該酶特異性識(shí)別單鏈或雙鏈DNA鏈上的尿嘧啶堿基 (dU)，對(duì)RNA無活性，對(duì)待檢測(cè)的不含尿嘧啶堿基的DNA無影響。因此，在DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)DG，可有效防止外來擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。具體原理如下：

　　在DNA擴(kuò)增反應(yīng)底物dNTPs中摻入dUTP，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中即含有dU。如果反應(yīng)體系被含有dU的外來擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染，在擴(kuò)增反應(yīng)之前，UDG可在常溫下催化水解外來DNA鏈中的尿嘧啶堿基和脫氧核糖骨架之間的N-糖苷鍵，產(chǎn)生缺堿基 (AP) 位點(diǎn)，然后將UDG失活。在隨后擴(kuò)增反應(yīng)的高溫下，含有AP位點(diǎn)的DNA骨架水解斷裂，從而降解了外來擴(kuò)增產(chǎn)物。而本次新加入的反應(yīng)模板不含dU，不受UDG影響。

愚公百時(shí)美——熱敏UDG

　　使用UDG降解外來擴(kuò)增產(chǎn)物后，在擴(kuò)增前必須將UDG失活，否則會(huì)降解本次擴(kuò)增產(chǎn)物，影響擴(kuò)增結(jié)果。目前市場(chǎng)上普通UDG產(chǎn)品來源于大腸桿菌等，熱穩(wěn)定性高，95℃孵育10 min仍可能有殘留活性（數(shù)據(jù)來源NEB），對(duì)后續(xù)PCR有潛在影響，更不能用于一步法RT-qPCR和LAMP。

　　愚公生物/百時(shí)美新近推出的熱敏UDG (HL-UDG) 來源于冷水生物，對(duì)溫度較為敏感，50℃下孵育5min即可完全失活，解決了常規(guī)UDG難以熱失活的問題，并且可用于一步法RT-qPCR和LAMP。

產(chǎn)品特性：

1、50℃下徹底不可逆的失活。

2、保持PCR產(chǎn)物的完整性。

3、適用于PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、LAMP污染控制。

性能展示：

1、熱敏感，50℃徹底不可逆失活

圖1 HL-UDG 在50℃下徹底不可逆失活。A：將1 U的HL-UDG分別在50℃、70℃、95℃條件下孵育10min后與含dU底物25℃下反應(yīng)。消化的底物電泳條帶無明顯變化。B：該酶50℃ 下5min、10min失活后的熒光值均與不加UDG的熒光值接近。

2、保持PCR產(chǎn)物的完整性

圖2 HL-UDG不影響PCR產(chǎn)物的完整性。A：在PCR體系中加HL-UDG，在37℃下孵育0、1、2、4、6、8h，凝膠電泳結(jié)果顯示加或不加HL-UDG，PCR產(chǎn)物條帶無明顯變化。B：在PCR體系中加HL-UDG，37℃下孵育8h的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示序列完整。

3、 兼容qPCR體系&消化徹底