切刻內(nèi)切酶—體外診斷新工具
2020年3月30日，時任美國總統(tǒng)特朗普和美國FDA局長哈恩在白宮草坪上舉行記者招待會，現(xiàn)場推介雅培的ID NOW便攜式核酸檢測儀，號稱其最快能夠在5分鐘內(nèi)檢測新冠病毒RNA。這款I(lǐng)VD史上最牛“直播帶貨”推介的快速診斷設(shè)備，使用的就是切刻酶擴(kuò)增反應(yīng) (Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR) 技術(shù)。
圖1 特朗普為ID NOW“帶貨”
切刻內(nèi)切酶 (nicking endonuclease) 是一類特殊的Type II限制酶，只切割DNA雙鏈中特定的一條鏈（見《限制酶分類知多少（上）》），形成切刻缺口。利用切刻內(nèi)切酶和等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，研究者開發(fā)了一系列新型快速檢測技術(shù)，為體外診斷提供了許多有力的新工具[1]。下面就讓我們來了解一下近年來幾項(xiàng)具有代表性的切刻酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
NEAR技術(shù)是在鏈置換擴(kuò)增反應(yīng) (SDA) 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，又被稱為切刻酶輔助擴(kuò)增 (NEAA)或切刻酶介導(dǎo)擴(kuò)增 (NEMA)，最早由Ionian公司在2008年開發(fā)并形成專利[2]，后輾轉(zhuǎn)被雅培收購。NEAR技術(shù)主要使用耐熱的切刻內(nèi)切酶（如Nt.BstNBI、Nt.BspQI等）和具有鏈置換活性的DNA聚合酶（如Bst DNA聚合酶等）[3]，通過一對特殊設(shè)計(jì)的帶有切刻酶識別序列的引物，最快可以在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109倍擴(kuò)增。
NEAR技術(shù)核心原理見圖2。
(i) 反向引物R的3'端B'區(qū)域與待測模板上互補(bǔ)的B區(qū)域退火配對，DNA聚合酶開始擴(kuò)增延伸反向引物R。
(ii) 在DNA聚合酶的鏈置換活性作用下，第2條反向引物結(jié)合到第1條反向引物開始結(jié)合的位置，將第1次反向擴(kuò)增的單鏈產(chǎn)物置換下來。
(iii) 正向引物F的3'端A區(qū)域與反向擴(kuò)增產(chǎn)物上互補(bǔ)的A'區(qū)域退火配對，DNA聚合酶開始擴(kuò)增延伸正向引物F。
(iv) 擴(kuò)增產(chǎn)物下游含有完整的切刻酶識別位點(diǎn)N和酶切位點(diǎn)X，切刻酶切割單鏈形成切刻缺口。
(v) 反向擴(kuò)增產(chǎn)物上酶切位點(diǎn)X下游的單鏈解離釋放，DNA聚合酶從X開始擴(kuò)增延伸。
(vi) 形成NEAR擴(kuò)增雙鏈，上下游各帶有一個不同方向的切刻酶酶切位點(diǎn)X。
(vii) 切刻酶在上下游分別切割，形成兩種切刻缺口；DNA聚合酶分別從兩個缺口向各自下游擴(kuò)增。
(viii) 生成兩種只帶有一個切刻酶酶切位點(diǎn)X的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物；切刻酶分別在兩種雙鏈產(chǎn)物上切割，切刻缺口下游的單鏈解離，形成AB和A'B'兩種單鏈探針。
(ix) 兩種單鏈探針分別能與正反向引物中對應(yīng)的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，引發(fā)新一輪擴(kuò)增，循環(huán)產(chǎn)生(viii) 中的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。
指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng) (EXPAR)
2021年，英國伯明翰大學(xué)研究者在《美國國家科學(xué)院院刊》(PNAS) 上發(fā)表論文，提出了一種不依賴逆轉(zhuǎn)錄的新冠病毒核酸檢測技術(shù)，即無逆轉(zhuǎn)錄指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng) (RTF-EXPAR)，能夠在50-60℃恒溫下，8分鐘內(nèi)檢測出低至7.25拷貝/μl的新冠病毒RNA；而靈敏度和特異性與現(xiàn)有技術(shù)相當(dāng)[6]。2022年，該技術(shù)被獨(dú)家授權(quán)給Innova Medical Group, Inc.
這里用到的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng) (Exponential Amplification Reaction, EXPAR) 最早出現(xiàn)于2003年[7]，前面介紹的NEAR技術(shù)其實(shí)與它有異曲同工之妙。與NEAR不同，EXPAR技術(shù)利用單鏈觸發(fā)探針 (Trigger) X和單鏈功能模板 (Functional template) X'-X'（X'與探針X互補(bǔ)，兩段重復(fù)的X'之間由切刻酶的酶切位點(diǎn)連接），在切刻內(nèi)切酶 (如Nt.BstNBI、Nt.BspQI等) 和具有鏈置換活性的DNA聚合酶（如Bst DNA聚合酶等）的共同作用下，能夠在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)106-109倍的擴(kuò)增。
EXPAR技術(shù)核心原理見圖3。
(i) 觸發(fā)探針X與功能模板X'-X'上游的X'互補(bǔ)配對；
(ii) 在DNA聚合酶的作用下，以X為引物向下游擴(kuò)增，形成X-X / X'-X'雙鏈；
(iii) 切刻內(nèi)切酶在X-X / X'-X'雙鏈中間切割，形成切刻缺口；
(iv) 具有鏈置換活性的DNA聚合酶在切刻處，以上游X為引物進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，下游原有的X被置換脫落；
(v) 游離的觸發(fā)探針X再與單鏈X'-X'結(jié)合，觸發(fā)新一輪循環(huán)。
大家可能注意到，EXPAR的功能模板X'-X'比較特殊，要求兩段完全相同的重復(fù)序列X'之間還要有切刻酶的識別位點(diǎn)，這種序列很難在天然的DNA或RNA中找到。因此實(shí)際的EXPAR反應(yīng)中一般不加入觸發(fā)探針X，而只加入人工合成的功能模板X'-X'，以及一段用于啟動最初幾輪反應(yīng)的起始單鏈探針[8]。
EXPAR檢測基因組DNA的常用起始策略如圖4所示。
(i) 基因組DNA變性后，與能和基因組互補(bǔ)配對的起始探針X'-Y'（Y'與X'序列不同，之間仍由切刻內(nèi)切酶識別位點(diǎn)連接）退火；切刻內(nèi)切酶切割形成切刻缺口。
(ii) 具有鏈置換活性的DNA聚合酶在切刻缺口處以X'為模板開始擴(kuò)增，原基因組DNA切口下游的單鏈被置換解離。
(iii) 切刻內(nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物形成切刻缺口。
(iv) 具有鏈置換活性的DNA聚合酶再在缺口處以X'為模板進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，本次被置換下來的單鏈DNA即為觸發(fā)探針X。
(v) 觸發(fā)探針X與預(yù)先加入的功能模板X'-X'互補(bǔ)配對，開始后續(xù)的EXPAR循環(huán)。
伯明翰大學(xué)開發(fā)的RTF-EXPAR技術(shù)，檢測RNA時用了另一種起始策略，除了用到切刻內(nèi)切酶，還需要另一種Type IIP限制酶，但不需要逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
基本原理如圖5所示。
(i) 單鏈DNA粘結(jié)探針 (binder DNA) 的3'部分與RNA退火。粘結(jié)探針包括觸發(fā)探針X（只有3'部分與RNA互補(bǔ)）、限制酶識別位點(diǎn)和另外一小段與RNA模板互補(bǔ)的片段，Tm高于反應(yīng)溫度。
(ii) 限制酶識別DNA-RNA雜合雙鏈，但只切割DNA鏈。
(iii) 在等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)溫度下（接近X與RNA配對部分的Tm），X與RNA解鏈脫離，成為觸發(fā)探針。
(iv)觸發(fā)探針X與預(yù)先加入的功能模板X'-X'互補(bǔ)配對，開始后續(xù)的EXPAR循環(huán)。
EXPAR技術(shù)具有反應(yīng)快、靈敏度高、探針設(shè)計(jì)靈活、可檢測短片段等優(yōu)勢，可以通過熒光染料、熒光基團(tuán)、電化學(xué)或納米顆粒等各種方式產(chǎn)生信號，已經(jīng)被嘗試用于檢測核酸（DNA、mRNA、miRNA等）、蛋白質(zhì)、酶活和金屬離子等[8]，還可以與CRISPR/Cas技術(shù)結(jié)合進(jìn)一步提高靈敏度和特異性[9]。但EXPAR技術(shù)也存在探針設(shè)計(jì)難度大、非特異擴(kuò)增較嚴(yán)重等缺點(diǎn)，目前已有一些生物信息學(xué)方法來輔助EXPAR探針設(shè)計(jì)[10]，也有研究者探索了一些降低EXPAR非特異性擴(kuò)增的策略。
結(jié)語
除上面介紹的NEAR和EXPAR技術(shù)之外，切刻酶相關(guān)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)還有鏈置換擴(kuò)增 (SDA)、滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA) 等，本文限于篇幅不再展開。這些技術(shù)以快速、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，被用于體外診斷和科學(xué)研究等多個領(lǐng)域，以及合成生物學(xué)領(lǐng)域中構(gòu)建DNA動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11]，未來發(fā)展空間巨大。
相關(guān)產(chǎn)品
參考文獻(xiàn)：
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2. Maples et al. (2009) U.S. Patent US20090017453A1
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10. Qian et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:e87
11. Zhang et al. (2019) J Am Chem Soc. 141:17189–17197
