01 中國的限制酶相關研究

由于歷史原因，中國的現代分子生物學研究直到20世紀70年代才真正起步，落后國外近20年。欲先善其事，必先利其器，分子生物學研究需要眾多工具酶和試劑。當時國外已有NEB、Fermentas等公司供應分子生物學試劑，但對于當時的中國科研人員來說價格非常昂貴，購買也很困難。于是大家只能自己動手，豐衣足食，在簡陋艱苦的條件下，自行開始分離純化限制酶的探索。

1978年，也就是Arber、Nathans和Smith因發(fā)現限制酶而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎的同年，我國核酸生化領域的奠基人、中科院上海生化所王德寶研究員（1980年當選為中科院學部委員）帶領團隊，從流感嗜血桿菌的三個不同菌株中分離純化獲得了三種限制酶，分別命名為HinP₁I、HinS₁I、HinS₂I。其中HinS₁I、HinS₂I是HhaI的同裂酶，而HinP₁I是HhaI的異裂酶。相關成果于1980年發(fā)表在《中國科學》上（圖1），這是中國最早關于限制酶的研究報道，也是中國第一次自主鑒定獲得限制酶。

圖1 中國第一篇限制酶研究論文

短短兩三年內，中科院上海生化所李載平團隊（1996年當選為中國工程院院士）、中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所梁植權團隊（1980年當選為中科院學部委員）、中科院生物物理所陳受宜團隊、中科院上海細胞所匡達人團隊、中科院微生物研究所張靜娟、武漢大學病毒學系、中山大學羅進賢、軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所谷志遠等，分別參照國外文獻或自主改良方法，先后提取純化了BglI、BglII、PstI、BamHI、EcoRI、HpaII、AluI、SalI等十幾種常用的限制酶，純度和性能均不亞于當時國外同類產品。這些先驅者的辛勤工作，為正在起步的中國分子生物學研究提供了寶貴而及時的工具。

值得一提的是，1982-1984年，時任中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所助理研究員的強伯勤（1991年當選為中科院學部委員）赴NEB做訪問學者。在此期間，他在NEB主持鑒定了首批八堿基高特異性限制酶SfiI和NotI（NotI目前仍是NEB銷量最大的限制酶之一），還發(fā)現了NlaIII，NlaIV，NslI等一系列新的限制酶。

此后又有不少中國學者零星地從事限制酶鑒定、分離和純化的研究，也鑒定出了少量國外未曾報道的限制酶，但均未形成商業(yè)化產品。僅有1994年復旦大學陳中孚等在NEB的資助下從脂肪嗜熱芽孢桿菌GR75中分離獲得限制酶BsrGI，并進入NEB產品目錄。

在從天然細菌中分離純化限制酶的基礎上，2000年，中國協和醫(yī)科大學劉金毅等報道了限制酶EcoRII的重組表達過程，產率和純度均高于國外文獻。這是國內首次重組表達限制酶。此后，又有一些科研院所和公司也陸續(xù)開展了限制酶重組表達、發(fā)酵、純化的研究，并形成了一批論文和專利，但主要是滿足自用需求，也未能形成體系化的產品。

除了限制酶的分離、表達、純化外，也有少數中國學者對限制酶的功能、機制進行了一些研究。早在1982年，中科院上海生化所陳常慶研究員團隊就對限制酶EcoRI的底物專一性進行了研究。20世紀八九十年代，武漢大學生物系鄒國林老師對限制酶的活性、結合機制、反應動力學都進行了較為系統(tǒng)的研究。近年來，也有一些國內研究者對限制酶的結構進行了一些探索，但均未形成較大影響力。

圖2 限制酶DraIII的N端和C端結構域相互作用

T181A突變破壞了T181和D55之間的氫鍵，大幅降低了DraIII的星號活性

與限制酶相關研究相比，在限制酶的商業(yè)化道路上，中國則走得更加坎坷。

1985年，真正意義上的中國分子生物學試劑先驅——中外合資的華美生物工程公司在河南洛陽成立。為什么會落在河南，坊間還有一段八卦。據說美國著名試劑商Promega某創(chuàng)始人的父親曾于上世紀30年代在河南一帶傳教，有了一段情結。后來該創(chuàng)始人80年代初到河南替父還愿，與當地政府一拍即合，與洛陽肉聯廠（即后來的春都集團）、中信興業(yè)三家合資成立了華美生物。

華美生物成立僅三年，就能生產80余種生物試劑，其中12項填補國內空白，11項達到了80年代中期國際先進水平，1989年就能夠向美國出口分子生物學產品，成為當時國內唯一的、專業(yè)化、高水平的工具酶供應基地。此后華美生物又進軍體外診斷行業(yè)，陸續(xù)開發(fā)出甲肝、乙肝、丙肝、HIV等多種病毒的酶聯免疫檢測試劑盒，2003年還率先在國內研制出SARS病毒診斷試劑。20世紀90年代發(fā)表的不少中文論文里，都說限制酶購自華美生物；然而也有地方提到當時華美生物只能自產DNA聚合酶等分子試劑，限制酶產品是Promega進口分裝。具體如何，因年代久遠已不可考。

可惜進入21世紀后，由于股東變更和后續(xù)的一系列謎之操作，華美生物在2004年被提請破產。2009年被收購后，重新在洛陽成立華美生物工程有限公司，但傷筋動骨，早已不復當年之勇。無論如何，作為中國生物技術行業(yè)的“黃埔軍校”，華美生物值得在中國生物技術發(fā)展史上留下濃重的一筆。

圖4 當年的華美生物工程公司

在華美生物提請破產之后的十余年間，DNA聚合酶、連接酶、逆轉錄酶等分子生物學常用工具酶一一被中國企業(yè)攻克，實現了國產替代。但國內限制酶市場從Promega，到后來的NEB、Fermentas/ThermoFisher、Takara三分天下，還是難覓中國企業(yè)身影。

限制酶大規(guī)模生產為什么這么困難？主要有三個原因。第一，限制酶能夠切割基因組DNA，在工程細菌中重組表達會引起細胞毒性，需要耗費大量精力篩選保護菌株和發(fā)酵工藝；第二，限制酶品種眾多，單做幾種不能滿足市場需求，但不同限制酶之間氨基酸序列差異大，性質不同，工藝需要逐個攻克；第三，限制酶產品中不能有其他核酸酶殘留，對純化工藝要求很高。

2015年，一群“不知天高地厚”的年輕人決心要搬掉限制酶這座橫亙在中國生物技術發(fā)展之路上的大山。他們以中國古代神話《愚公移山》激勵自己，將團隊也稱為“愚公”，并將限制酶研發(fā)計劃定名為“王屋計劃”。2016年，愚公成功獲得了首批限制酶產品。

時至今日，愚公生物（含旗下百時美生物）已經推出72種限制酶產品，其中包含62種LightNing系列快切酶、3種GMP級別限制酶和2種切刻內切酶，覆蓋了90%以上的限制酶應用場景，2023年國內市場占有率位居第三。

以限制酶為基礎，愚公生物建立了國內領先的毒性蛋白研發(fā)平臺，將產品線進一步拓展到其他毒性蛋白工具酶。未來，愚公生物將繼續(xù)堅持“創(chuàng)造酶好生活（Best Enzyme for Better Life）”的愿景，繼承老一輩科學家的精神，不斷守正創(chuàng)新，為中國生物醫(yī)學行業(yè)提供更多優(yōu)質、經濟、方便的工具酶產品，助推中國生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展。