常見問題解答
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Q:
雷霆系列限制性內(nèi)切酶的穩(wěn)定性如何？運(yùn)輸過程中凍融會(huì)對(duì)酶的活力產(chǎn)生影響嗎？
A:運(yùn)輸過程中以干冰保持低溫運(yùn)輸，酶有結(jié)冰的可能，但是這對(duì)于雷霆系列的限制性內(nèi)切酶的質(zhì)量沒有影響，我們對(duì)所有的酶都進(jìn)行了至少三次的凍融實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果表示，酶的活性仍舊是100%。您收到的酶可能是冰袋運(yùn)輸?shù)?，?qǐng)不要擔(dān)心，這僅僅是由當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷商運(yùn)到您的實(shí)驗(yàn)室過程中采取的運(yùn)輸方案，我們經(jīng)過嚴(yán)格的檢測(cè)，暴露在4℃下經(jīng)過24~48 h后仍然不受影響。
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Q:
除了高溫還有什么方法能夠讓雷霆系列限制性內(nèi)切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）
A:可以使用EDTA終止反應(yīng)，或者以SDS等蛋白質(zhì)變性劑使得酶變性。如果酶切產(chǎn)物還要用于下游實(shí)驗(yàn)?zāi)敲纯梢杂媚z回收試劑盒進(jìn)行DNA清潔，回收后酶切反應(yīng)就被終止了。
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Q:
酶切反應(yīng)完成后跑凝膠電泳，結(jié)果條帶與預(yù)期不符，可能原因有哪些？
A:可能原因有如下幾個(gè)：
• 限制性內(nèi)切酶表現(xiàn)出星活性：確保酶切反應(yīng)是嚴(yán)格按照說明書推薦的步驟進(jìn)行的。如果是由星活性引起的那么有以下幾個(gè)解決方法：①減少反應(yīng)時(shí)間；②增加反應(yīng)體系的體積；③減少反應(yīng)中酶的含量。
• 酶切不完全（一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)有部分DNA底物未被切開），可以嘗試加多酶量或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。如果上面的嘗試不能很好地解決問題，請(qǐng)從DNA底物上尋找解決方案，DNA底物中是否含有酶切反應(yīng)抑制劑，將DNA純化后再進(jìn)行反應(yīng)；DNA是否被甲基化，胞內(nèi)的甲基化系統(tǒng)能夠使DNA的特定堿基發(fā)生甲基化，而這些甲基化的堿基對(duì)于酶切反應(yīng)有著不同程度的抑制。
• 被未知限制性內(nèi)切酶污染：未知的限制性內(nèi)切酶可能通過不當(dāng)?shù)牟僮?、不純凈的DNA底物、不潔凈的管子等途徑摻入酶切反應(yīng)中。
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Q:
有哪些關(guān)鍵因素會(huì)導(dǎo)致星活性？
A:長(zhǎng)時(shí)間孵育、過量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應(yīng)體系等因素都會(huì)導(dǎo)致星活性的產(chǎn)生。
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Q:
未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接酶切要怎樣設(shè)定體系？
A:反應(yīng)體系推薦由這些內(nèi)容組成：10 μl PCR產(chǎn)物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、ddH2O補(bǔ)齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度而定，只加入2 μl反應(yīng)緩沖液的原因是PCR反應(yīng)中存在對(duì)應(yīng)的鹽離子和金屬離子，適當(dāng)減少反應(yīng)緩沖液的用量以保證最終反應(yīng)體系中的環(huán)境適宜限制性內(nèi)切酶發(fā)揮功能。
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Q:
雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力定義是怎樣的？
A:雷霆系列限制性內(nèi)切酶1 U的定義是正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量。
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Q:
雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力單位與Thermo Fisher的活力單位或者 NEB的活力單位應(yīng)該如何換算？
A:由于反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)體系不同，活力單位無法直接換算。雷霆系列限制性內(nèi)切酶活力單位是依據(jù)反應(yīng)進(jìn)行定義的，正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量為1 U，也就是說反應(yīng)中加入與DNA底物成比例的酶量即可完成反應(yīng)。
