切刻內(nèi)切酶—體外診斷新工具
2020年3月30日，時任美國總統(tǒng)特朗普和美國FDA局長哈恩在白宮草坪上舉行記者招待會，現(xiàn)場推介雅培的ID NOW便攜式核酸檢測儀，號稱其最快能夠在5分鐘內(nèi)檢測新冠病毒RNA。這款IVD史上最牛“直播帶貨”推介的快速診斷設備，使用的就是切刻酶擴增反應 (Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR) 技術。
圖1 特朗普為ID NOW“帶貨”
切刻內(nèi)切酶 (nicking endonuclease) 是一類特殊的Type II限制酶，只切割DNA雙鏈中特定的一條鏈（見《限制酶分類知多少（上）》），形成切刻缺口。利用切刻內(nèi)切酶和等溫擴增反應，研究者開發(fā)了一系列新型快速檢測技術，為體外診斷提供了許多有力的新工具[1]。下面就讓我們來了解一下近年來幾項具有代表性的切刻酶等溫擴增技術。
NEAR技術是在鏈置換擴增反應 (SDA) 技術基礎上發(fā)展而來的一種快速等溫擴增技術，又被稱為切刻酶輔助擴增 (NEAA)或切刻酶介導擴增 (NEMA)，最早由Ionian公司在2008年開發(fā)并形成專利[2]，后輾轉被雅培收購。NEAR技術主要使用耐熱的切刻內(nèi)切酶（如Nt.BstNBI、Nt.BspQI等）和具有鏈置換活性的DNA聚合酶（如Bst DNA聚合酶等）[3]，通過一對特殊設計的帶有切刻酶識別序列的引物，最快可以在5 min內(nèi)實現(xiàn)109倍擴增。
NEAR技術核心原理見圖2。
(i) 反向引物R的3'端B'區(qū)域與待測模板上互補的B區(qū)域退火配對，DNA聚合酶開始擴增延伸反向引物R。
(ii) 在DNA聚合酶的鏈置換活性作用下，第2條反向引物結合到第1條反向引物開始結合的位置，將第1次反向擴增的單鏈產(chǎn)物置換下來。
(iii) 正向引物F的3'端A區(qū)域與反向擴增產(chǎn)物上互補的A'區(qū)域退火配對，DNA聚合酶開始擴增延伸正向引物F。
(iv) 擴增產(chǎn)物下游含有完整的切刻酶識別位點N和酶切位點X，切刻酶切割單鏈形成切刻缺口。
(v) 反向擴增產(chǎn)物上酶切位點X下游的單鏈解離釋放，DNA聚合酶從X開始擴增延伸。
(vi) 形成NEAR擴增雙鏈，上下游各帶有一個不同方向的切刻酶酶切位點X。
(vii) 切刻酶在上下游分別切割，形成兩種切刻缺口；DNA聚合酶分別從兩個缺口向各自下游擴增。
(viii) 生成兩種只帶有一個切刻酶酶切位點X的雙鏈擴增產(chǎn)物；切刻酶分別在兩種雙鏈產(chǎn)物上切割，切刻缺口下游的單鏈解離，形成AB和A'B'兩種單鏈探針。
(ix) 兩種單鏈探針分別能與正反向引物中對應的互補區(qū)域結合，引發(fā)新一輪擴增，循環(huán)產(chǎn)生(viii) 中的雙鏈擴增產(chǎn)物。
指數(shù)擴增反應 (EXPAR)
2021年，英國伯明翰大學研究者在《美國國家科學院院刊》(PNAS) 上發(fā)表論文，提出了一種不依賴逆轉錄的新冠病毒核酸檢測技術，即無逆轉錄指數(shù)擴增反應 (RTF-EXPAR)，能夠在50-60℃恒溫下，8分鐘內(nèi)檢測出低至7.25拷貝/μl的新冠病毒RNA；而靈敏度和特異性與現(xiàn)有技術相當[6]。2022年，該技術被獨家授權給Innova Medical Group, Inc.
這里用到的指數(shù)擴增反應 (Exponential Amplification Reaction, EXPAR) 最早出現(xiàn)于2003年[7]，前面介紹的NEAR技術其實與它有異曲同工之妙。與NEAR不同，EXPAR技術利用單鏈觸發(fā)探針 (Trigger) X和單鏈功能模板 (Functional template) X'-X'（X'與探針X互補，兩段重復的X'之間由切刻酶的酶切位點連接），在切刻內(nèi)切酶 (如Nt.BstNBI、Nt.BspQI等) 和具有鏈置換活性的DNA聚合酶（如Bst DNA聚合酶等）的共同作用下，能夠在幾分鐘內(nèi)實現(xiàn)106-109倍的擴增。
EXPAR技術核心原理見圖3。
(i) 觸發(fā)探針X與功能模板X'-X'上游的X'互補配對；
(ii) 在DNA聚合酶的作用下，以X為引物向下游擴增，形成X-X / X'-X'雙鏈；
(iii) 切刻內(nèi)切酶在X-X / X'-X'雙鏈中間切割，形成切刻缺口；
(iv) 具有鏈置換活性的DNA聚合酶在切刻處，以上游X為引物進行鏈置換擴增，下游原有的X被置換脫落；
(v) 游離的觸發(fā)探針X再與單鏈X'-X'結合，觸發(fā)新一輪循環(huán)。
大家可能注意到，EXPAR的功能模板X'-X'比較特殊，要求兩段完全相同的重復序列X'之間還要有切刻酶的識別位點，這種序列很難在天然的DNA或RNA中找到。因此實際的EXPAR反應中一般不加入觸發(fā)探針X，而只加入人工合成的功能模板X'-X'，以及一段用于啟動最初幾輪反應的起始單鏈探針[8]。
EXPAR檢測基因組DNA的常用起始策略如圖4所示。
(i) 基因組DNA變性后，與能和基因組互補配對的起始探針X'-Y'（Y'與X'序列不同，之間仍由切刻內(nèi)切酶識別位點連接）退火；切刻內(nèi)切酶切割形成切刻缺口。
(ii) 具有鏈置換活性的DNA聚合酶在切刻缺口處以X'為模板開始擴增，原基因組DNA切口下游的單鏈被置換解離。
(iii) 切刻內(nèi)切酶切割擴增產(chǎn)物形成切刻缺口。
(iv) 具有鏈置換活性的DNA聚合酶再在缺口處以X'為模板進行鏈置換擴增，本次被置換下來的單鏈DNA即為觸發(fā)探針X。
(v) 觸發(fā)探針X與預先加入的功能模板X'-X'互補配對，開始后續(xù)的EXPAR循環(huán)。
伯明翰大學開發(fā)的RTF-EXPAR技術，檢測RNA時用了另一種起始策略，除了用到切刻內(nèi)切酶，還需要另一種Type IIP限制酶，但不需要逆轉錄反應。
基本原理如圖5所示。
(i) 單鏈DNA粘結探針 (binder DNA) 的3'部分與RNA退火。粘結探針包括觸發(fā)探針X（只有3'部分與RNA互補）、限制酶識別位點和另外一小段與RNA模板互補的片段，Tm高于反應溫度。
(ii) 限制酶識別DNA-RNA雜合雙鏈，但只切割DNA鏈。
(iii) 在等溫擴增反應溫度下（接近X與RNA配對部分的Tm），X與RNA解鏈脫離，成為觸發(fā)探針。
(iv)觸發(fā)探針X與預先加入的功能模板X'-X'互補配對，開始后續(xù)的EXPAR循環(huán)。
EXPAR技術具有反應快、靈敏度高、探針設計靈活、可檢測短片段等優(yōu)勢，可以通過熒光染料、熒光基團、電化學或納米顆粒等各種方式產(chǎn)生信號，已經(jīng)被嘗試用于檢測核酸（DNA、mRNA、miRNA等）、蛋白質(zhì)、酶活和金屬離子等[8]，還可以與CRISPR/Cas技術結合進一步提高靈敏度和特異性[9]。但EXPAR技術也存在探針設計難度大、非特異擴增較嚴重等缺點，目前已有一些生物信息學方法來輔助EXPAR探針設計[10]，也有研究者探索了一些降低EXPAR非特異性擴增的策略。
結語
除上面介紹的NEAR和EXPAR技術之外，切刻酶相關的等溫擴增技術還有鏈置換擴增 (SDA)、滾環(huán)擴增 (RCA) 等，本文限于篇幅不再展開。這些技術以快速、高靈敏度等優(yōu)點，被用于體外診斷和科學研究等多個領域，以及合成生物學領域中構建DNA動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡[11]，未來發(fā)展空間巨大。
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參考文獻：
1. Cao et al. (2022) Int J Mol Sci. 23:4620
2. Maples et al. (2009) U.S. Patent US20090017453A1
3. Qian et al. (2019) Anal Chim Acta. 1050:1-15
4. Safiabadi et al. (2021) Clin Microbiol Rev. 34:e00228-20
5. Nie et al. (2014) J Clin Microbiol. 52:3339–3344
6. Carter et al. (2021) PNAS. 118:e2100347118
7. Ness et al. (2003) PNAS. 100:4504-4509
8. Reid et al. (2018) Angew Chem Int Ed. 57:11856-11866
9. Niu et al (2023) Anal Chim Acta. 1251:340998
10. Qian et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:e87
11. Zhang et al. (2019) J Am Chem Soc. 141:17189–17197
