01 中國的限制酶相關(guān)研究

由于歷史原因，中國的現(xiàn)代分子生物學(xué)研究直到20世紀(jì)70年代才真正起步，落后國外近20年。欲先善其事，必先利其器，分子生物學(xué)研究需要眾多工具酶和試劑。當(dāng)時(shí)國外已有NEB、Fermentas等公司供應(yīng)分子生物學(xué)試劑，但對(duì)于當(dāng)時(shí)的中國科研人員來說價(jià)格非常昂貴，購買也很困難。于是大家只能自己動(dòng)手，豐衣足食，在簡陋艱苦的條件下，自行開始分離純化限制酶的探索。

1978年，也就是Arber、Nathans和Smith因發(fā)現(xiàn)限制酶而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的同年，我國核酸生化領(lǐng)域的奠基人、中科院上海生化所王德寶研究員（1980年當(dāng)選為中科院學(xué)部委員）帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)，從流感嗜血桿菌的三個(gè)不同菌株中分離純化獲得了三種限制酶，分別命名為HinP₁I、HinS₁I、HinS₂I。其中HinS₁I、HinS₂I是HhaI的同裂酶，而HinP₁I是HhaI的異裂酶。相關(guān)成果于1980年發(fā)表在《中國科學(xué)》上（圖1），這是中國最早關(guān)于限制酶的研究報(bào)道，也是中國第一次自主鑒定獲得限制酶。

圖1 中國第一篇限制酶研究論文

短短兩三年內(nèi)，中科院上海生化所李載平團(tuán)隊(duì)（1996年當(dāng)選為中國工程院院士）、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所梁植權(quán)團(tuán)隊(duì)（1980年當(dāng)選為中科院學(xué)部委員）、中科院生物物理所陳受宜團(tuán)隊(duì)、中科院上海細(xì)胞所匡達(dá)人團(tuán)隊(duì)、中科院微生物研究所張靜娟、武漢大學(xué)病毒學(xué)系、中山大學(xué)羅進(jìn)賢、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所谷志遠(yuǎn)等，分別參照國外文獻(xiàn)或自主改良方法，先后提取純化了BglI、BglII、PstI、BamHI、EcoRI、HpaII、AluI、SalI等十幾種常用的限制酶，純度和性能均不亞于當(dāng)時(shí)國外同類產(chǎn)品。這些先驅(qū)者的辛勤工作，為正在起步的中國分子生物學(xué)研究提供了寶貴而及時(shí)的工具。

值得一提的是，1982-1984年，時(shí)任中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所助理研究員的強(qiáng)伯勤（1991年當(dāng)選為中科院學(xué)部委員）赴NEB做訪問學(xué)者。在此期間，他在NEB主持鑒定了首批八堿基高特異性限制酶SfiI和NotI（NotI目前仍是NEB銷量最大的限制酶之一），還發(fā)現(xiàn)了NlaIII，NlaIV，NslI等一系列新的限制酶。

此后又有不少中國學(xué)者零星地從事限制酶鑒定、分離和純化的研究，也鑒定出了少量國外未曾報(bào)道的限制酶，但均未形成商業(yè)化產(chǎn)品。僅有1994年復(fù)旦大學(xué)陳中孚等在NEB的資助下從脂肪嗜熱芽孢桿菌GR75中分離獲得限制酶BsrGI，并進(jìn)入NEB產(chǎn)品目錄。

在從天然細(xì)菌中分離純化限制酶的基礎(chǔ)上，2000年，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)劉金毅等報(bào)道了限制酶EcoRII的重組表達(dá)過程，產(chǎn)率和純度均高于國外文獻(xiàn)。這是國內(nèi)首次重組表達(dá)限制酶。此后，又有一些科研院所和公司也陸續(xù)開展了限制酶重組表達(dá)、發(fā)酵、純化的研究，并形成了一批論文和專利，但主要是滿足自用需求，也未能形成體系化的產(chǎn)品。

除了限制酶的分離、表達(dá)、純化外，也有少數(shù)中國學(xué)者對(duì)限制酶的功能、機(jī)制進(jìn)行了一些研究。早在1982年，中科院上海生化所陳常慶研究員團(tuán)隊(duì)就對(duì)限制酶EcoRI的底物專一性進(jìn)行了研究。20世紀(jì)八九十年代，武漢大學(xué)生物系鄒國林老師對(duì)限制酶的活性、結(jié)合機(jī)制、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)都進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。近年來，也有一些國內(nèi)研究者對(duì)限制酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一些探索，但均未形成較大影響力。

圖2 限制酶DraIII的N端和C端結(jié)構(gòu)域相互作用

T181A突變破壞了T181和D55之間的氫鍵，大幅降低了DraIII的星號(hào)活性

與限制酶相關(guān)研究相比，在限制酶的商業(yè)化道路上，中國則走得更加坎坷。

1985年，真正意義上的中國分子生物學(xué)試劑先驅(qū)——中外合資的華美生物工程公司在河南洛陽成立。為什么會(huì)落在河南，坊間還有一段八卦。據(jù)說美國著名試劑商Promega某創(chuàng)始人的父親曾于上世紀(jì)30年代在河南一帶傳教，有了一段情結(jié)。后來該創(chuàng)始人80年代初到河南替父還愿，與當(dāng)?shù)卣慌募春?，與洛陽肉聯(lián)廠（即后來的春都集團(tuán)）、中信興業(yè)三家合資成立了華美生物。

華美生物成立僅三年，就能生產(chǎn)80余種生物試劑，其中12項(xiàng)填補(bǔ)國內(nèi)空白，11項(xiàng)達(dá)到了80年代中期國際先進(jìn)水平，1989年就能夠向美國出口分子生物學(xué)產(chǎn)品，成為當(dāng)時(shí)國內(nèi)唯一的、專業(yè)化、高水平的工具酶供應(yīng)基地。此后華美生物又進(jìn)軍體外診斷行業(yè)，陸續(xù)開發(fā)出甲肝、乙肝、丙肝、HIV等多種病毒的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，2003年還率先在國內(nèi)研制出SARS病毒診斷試劑。20世紀(jì)90年代發(fā)表的不少中文論文里，都說限制酶購自華美生物；然而也有地方提到當(dāng)時(shí)華美生物只能自產(chǎn)DNA聚合酶等分子試劑，限制酶產(chǎn)品是Promega進(jìn)口分裝。具體如何，因年代久遠(yuǎn)已不可考。

可惜進(jìn)入21世紀(jì)后，由于股東變更和后續(xù)的一系列謎之操作，華美生物在2004年被提請(qǐng)破產(chǎn)。2009年被收購后，重新在洛陽成立華美生物工程有限公司，但傷筋動(dòng)骨，早已不復(fù)當(dāng)年之勇。無論如何，作為中國生物技術(shù)行業(yè)的“黃埔軍校”，華美生物值得在中國生物技術(shù)發(fā)展史上留下濃重的一筆。

圖4 當(dāng)年的華美生物工程公司

在華美生物提請(qǐng)破產(chǎn)之后的十余年間，DNA聚合酶、連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等分子生物學(xué)常用工具酶一一被中國企業(yè)攻克，實(shí)現(xiàn)了國產(chǎn)替代。但國內(nèi)限制酶市場從Promega，到后來的NEB、Fermentas/ThermoFisher、Takara三分天下，還是難覓中國企業(yè)身影。

限制酶大規(guī)模生產(chǎn)為什么這么困難？主要有三個(gè)原因。第一，限制酶能夠切割基因組DNA，在工程細(xì)菌中重組表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞毒性，需要耗費(fèi)大量精力篩選保護(hù)菌株和發(fā)酵工藝；第二，限制酶品種眾多，單做幾種不能滿足市場需求，但不同限制酶之間氨基酸序列差異大，性質(zhì)不同，工藝需要逐個(gè)攻克；第三，限制酶產(chǎn)品中不能有其他核酸酶殘留，對(duì)純化工藝要求很高。

2015年，一群“不知天高地厚”的年輕人決心要搬掉限制酶這座橫亙?cè)谥袊锛夹g(shù)發(fā)展之路上的大山。他們以中國古代神話《愚公移山》激勵(lì)自己，將團(tuán)隊(duì)也稱為“愚公”，并將限制酶研發(fā)計(jì)劃定名為“王屋計(jì)劃”。2016年，愚公成功獲得了首批限制酶產(chǎn)品。

時(shí)至今日，愚公生物（含旗下百時(shí)美生物）已經(jīng)推出72種限制酶產(chǎn)品，其中包含62種LightNing系列快切酶、3種GMP級(jí)別限制酶和2種切刻內(nèi)切酶，覆蓋了90%以上的限制酶應(yīng)用場景，2023年國內(nèi)市場占有率位居第三。

以限制酶為基礎(chǔ)，愚公生物建立了國內(nèi)領(lǐng)先的毒性蛋白研發(fā)平臺(tái)，將產(chǎn)品線進(jìn)一步拓展到其他毒性蛋白工具酶。未來，愚公生物將繼續(xù)堅(jiān)持“創(chuàng)造酶好生活（Best Enzyme for Better Life）”的愿景，繼承老一輩科學(xué)家的精神，不斷守正創(chuàng)新，為中國生物醫(yī)學(xué)行業(yè)提供更多優(yōu)質(zhì)、經(jīng)濟(jì)、方便的工具酶產(chǎn)品，助推中國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。