限制性內(nèi)切酶的前世今生
對于分子生物學(xué)和基因工程的從業(yè)者來說，限制性內(nèi)切酶（Restriction Enzymes，簡稱限制酶或內(nèi)切酶）是再熟悉不過的工具，在中學(xué)生物教科書中就有相當(dāng)篇幅的描述。限制酶能夠識別特定的DNA序列，并將DNA切開，被稱為DNA的“分子剪刀”。有了限制酶，人類才能夠開始對基因進(jìn)行各種編輯操作?？梢哉f，沒有限制酶，就沒有基因工程。今天，我們就走進(jìn)第一代基因編輯工具——限制酶的前世今生。
01 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)
限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和制備，使得人類可以開始對基因進(jìn)行剪切、組合等編輯操作，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及其在分子遺傳學(xué)方面的應(yīng)用，Werner Arber、Daniel Nathans和Hamilton Smith共同獲得了1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
圖二 瑞典1989年發(fā)行的諾貝爾獎紀(jì)念郵票。票面為限制酶切割DNA分子示意圖，左下方有三位獲獎?wù)叩拿?/p>
02 限制性內(nèi)切酶的商業(yè)化歷程
圖三 限制酶的商業(yè)化歷程
1974年，美國科學(xué)家Donald Comb辭去了哈佛醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系副教授的職位，在自家車庫里創(chuàng)辦了New England Biolabs（NEB）公司。1975年NEB推出的首批產(chǎn)品包含18個限制酶，第一年就實(shí)現(xiàn)了20萬美元的銷售收入，在那個年代是一筆非常豐厚的回報。此后，NEB始終秉承“By scientist, For scientist”（由科學(xué)家創(chuàng)建，為科學(xué)家服務(wù)）的精神，為分子生物學(xué)工作者提供各種優(yōu)質(zhì)的工具酶，僅限制酶產(chǎn)品就有270種，成為該領(lǐng)域的領(lǐng)軍企業(yè)。
圖四 NEB創(chuàng)始人Donald Comb (1927-2020)
在NEB發(fā)展歷程中還有一位關(guān)鍵人物Richard Roberts。1972年，他在聆聽了Daniel Nathans關(guān)于限制酶應(yīng)用的報告后，立即決定轉(zhuǎn)投這個領(lǐng)域。在1974年NEB創(chuàng)立之初，Roberts就擔(dān)任顧問兼科學(xué)咨詢委員會主席。他率先收集了各種已發(fā)現(xiàn)的限制酶信息，建立了第一個限制酶數(shù)據(jù)庫——REBASE，并由NEB維護(hù)至今。1992年，Roberts全職加入NEB擔(dān)任首席科學(xué)家直至今日。1993年，Richard Roberts因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)斷裂基因（即基因由外顯子和內(nèi)含子組成），而與Phillip Sharp共同獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。
圖五 NEB首個限制酶產(chǎn)品目錄
與此同時，冷戰(zhàn)鐵幕另一邊的蘇聯(lián)也在分子生物學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行著積極的探索。早在1962年，蘇聯(lián)政府就決定建立5個酶工廠，其中3個位于俄羅斯，1個位于哈薩克斯坦，1個位于立陶宛。立陶宛工廠于1970年建成，1971年投產(chǎn)，廠區(qū)內(nèi)的生物技術(shù)研究所也開始運(yùn)營。1975年，蘇聯(lián)應(yīng)用酶學(xué)研究所在立陶宛成立，Arvydas Janulaitis在此研發(fā)出蘇聯(lián)的第一個限制酶，并與NEB一起不斷豐富著REBASE。
圖六 蘇聯(lián)時期的立陶宛酶工廠及生物技術(shù)研究所
1990年，立陶宛等波羅的海三國宣布脫離蘇聯(lián)獨(dú)立，應(yīng)用酶學(xué)研究所也隨之拆分，留在立陶宛的Arvydas Janulaitis等人成立了MBI Fermentas，繼續(xù)從事分子生物學(xué)工具酶的商業(yè)化開發(fā)，陸續(xù)推出了188種限制酶產(chǎn)品，成為世界第二大限制酶供應(yīng)商。2010年，F(xiàn)ermentas被ThermoFisher Scientific整體收購。
圖七 2003年，理查德·羅伯茨（左起第5）帶領(lǐng)NEB團(tuán)隊(duì)（左起第4-6）訪問Fermentas時合影，最右為Arvydas Janulaitis
而在太平洋西側(cè)，成立于1925年的寶酒造株式會社（Takara Shuzo）也不滿足于在食品發(fā)酵行業(yè)的成就，決定進(jìn)軍生物酶領(lǐng)域。1979年，Takara推出了第一款限制酶產(chǎn)品。2002年，Takara的生命科學(xué)事業(yè)部獨(dú)立為Takara Bio，現(xiàn)擁有90種限制酶產(chǎn)品，成為世界第三大限制酶供應(yīng)商。除此之外，還有Roche、Promega、Toyobo等知名生物技術(shù)企業(yè)也曾自行開發(fā)了一些限制酶產(chǎn)品，但均已逐步退出市場。
目前已在各種微生物中發(fā)現(xiàn)了4000多種限制酶，其中約400種形成了商業(yè)化產(chǎn)品。早期的限制酶產(chǎn)品反應(yīng)時間較長，往往需要過夜；而且不同的酶在不同的緩沖液中活性差異很大，如果要使用兩個酶或多個酶切割同一個DNA分子，用一個酶切完之后，需要換用不同的緩沖液再加入第二個酶，使用起來非常麻煩。2006年，F(xiàn)ermentas率先嘗試通用緩沖液和快切，推出了FastDigest系列產(chǎn)品，這系列產(chǎn)品能夠在通用的FastDigest緩沖液中，僅需5-15分鐘即可完成酶切反應(yīng)，大大方便了用戶。然而，第一代FastDigest系列僅有19個產(chǎn)品，選擇余地太小，未能產(chǎn)生太大反響。2011年，收購了Fermentas的ThermoFisher重磅推出176種FastDigest系列快切酶，轟動了整個領(lǐng)域。隨后，Takara在2012年也推出了QuickCut系列快切酶，不過僅有37種產(chǎn)品。2013年，“老大”NEB終于也推出了Time-Saver系列快切酶，現(xiàn)有超過180種產(chǎn)品。限制酶全面進(jìn)入快速時代。
03 限制性內(nèi)切酶的國產(chǎn)化
時至今日，愚公生物（含旗下百時美生物）已推出63種限制酶產(chǎn)品，其中包含56種LightNing系列快切酶，覆蓋了90%以上的限制酶應(yīng)用場景，2022年國內(nèi)市場占有率達(dá)到6%。未來愚公生物將繼續(xù)堅持“創(chuàng)造酶好生活（Best Enzyme for Better Life）”的愿景，不斷守正創(chuàng)新，為中國生物醫(yī)學(xué)行業(yè)提供更多優(yōu)質(zhì)、經(jīng)濟(jì)、使用方便的工具酶產(chǎn)品，助推中國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
