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限制酶種類知多少（上）

發(fā)布時間：2024-03-13 發(fā)布人：
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自從1968年科學家首次鑒定到限制性內切酶之后（見：限制酶的前世今生），目前已有4000多種限制酶蛋白被鑒定出來。從1975年NEB首次推出限制酶產(chǎn)品至今，各家公司也已有近400種限制酶產(chǎn)品上市，是生物醫(yī)學工具酶中最龐大的家族。面對如此琳瑯滿目的限制酶，您知道如何將它們分類么？

 

01 命名方式

限制性內切酶的名稱通常由其來源物種的分類決定，屬名首字母+種名前兩位字母+血清型/菌株+同菌株的多種限制酶流水號羅馬數(shù)字。

例如HindIII：

“H”代表屬名Haemophilus

“in”代表種名influenzae

“d”代表血清型d

“III”用于區(qū)分來自于Haemophilus influenza血清型d的其它限制性內切酶（如HindII和HindIII）。

又例如Eco57I：

“E”代表屬名Escherichia

“co”代表種名coli

“57”代表RFL57菌株

“I”用于區(qū)分來自于Escherichia coli RFL57菌株的其它限制性內切酶。

早期的限制酶名稱寫法要求用斜體書寫前面代表菌株來源的字母，空一格后再用正體書寫最后的羅馬數(shù)字流水號，如Hind III，目前這種寫法在部分中文期刊上還被沿用?，F(xiàn)在國際上通行的寫法已經(jīng)不再需要斜體和空格，直接用正體書寫即可。

 

02 分類依據(jù)

 限制酶來源于細菌的“限制-修飾”(Restriction-Modification, R-M) 系統(tǒng)，是細菌免疫防御系統(tǒng)在胞內的第一道防線，是在噬菌體或其他入侵DNA尚未復制之前就降解其DNA。典型的R-M系統(tǒng)由限制酶 (REase) 和甲基轉移酶 (methyltransferase, MTase) 構成，通常成對出現(xiàn)，一般具有相同的DNA識別位點。限制酶識別雙鏈DNA上的特定序列并切割DNA，而甲基轉移酶對自身DNA同一識別位點上的腺嘌呤或胞嘧啶進行甲基化，保護自身DNA不被限制酶切割。通常情況下，含有R-M系統(tǒng)的細菌DNA在體內復制過程中被甲基化，而外來核酸（如噬菌體和質粒DNA）甲基化模式與細菌自身的甲基化模式不一致，能夠被細菌的限制酶識別并切割。

圖1 細菌利用“限制-修飾”系統(tǒng)抵御噬菌體入侵

 

因此，根據(jù)R-M系統(tǒng)的組成方式、DNA識別序列與切割位點特征、輔助因子需求等，可以將限制酶分為Type I、II、III、IV等4個大類。下面將分兩期詳細介紹限制酶的分類。

 

03 Type I

首批發(fā)現(xiàn)的限制酶EcoKI和EcoBI就是典型的Type I限制酶。這類限制酶的共同特點是：
（1） 由限制酶（R，由hsdR基因編碼）、甲基化酶（M，由hsdM基因編碼）和DNA特異性序列識別（S，由hsdS基因編碼）三種蛋白組成的五聚體復合物 (2R+2M+S)，分子量達到400 kDa，同時具有限制酶和甲基化酶活性。
（2）切割通常發(fā)生在距離識別位點很遠的位置（有時甚至相距2 kb以上），且距離不固定。
（3） 需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 作為輔助因子

從第二個特點可以明顯看出，Type I限制酶難以產(chǎn)生確定的切割產(chǎn)物，不適合作為基因工程工具酶。常用的基因工程菌株都需要將編碼Type I限制酶的hsd基因突變失活，從而避免外源質粒被降解。

 

04 Type II

在《限制酶的前世今生》中我們知道，因限制酶獲得諾貝爾獎的三位科學家中，Hamilton Smith首次從流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)HindII，而Dan Nathans使用HindII和其他限制酶切割SV40病毒DNA，首次構建了基因組的限制物理圖譜。這里的HindII就是第一種被發(fā)現(xiàn)的Type II限制酶。
在目前鑒定出的限制酶中，95%以上屬于Type II，這類限制酶的共同特點是：
（1） 大多數(shù)Type II限制酶和對應甲基化酶是獨立的兩個蛋白，但也有少數(shù)是限制酶和甲基化酶的融合蛋白。
（2） 切割位點位于識別序列內部，或者距離識別位點固定距離的位置。
（3） 大多數(shù)Type II限制酶只需要Mg2+作為輔助因子。
Type II限制酶能夠生成準確可控的酶切產(chǎn)物，易于鑒定和重組表達，成為基因工程中主要使用的限制酶。

Type II限制酶又可劃分為諸多亞類，目前發(fā)現(xiàn)的亞類有：

? Type IIP
這是我們最熟悉的限制酶類型，高中生物學教材上列舉的限制酶都是屬于這個亞類。Type IIP限制酶識別對稱的回文（palindromic，標注的首字母就是該亞類名稱的來源，下同）序列，切割位點位于回文序列內部或邊界（如PspGI：/CCWGG），產(chǎn)生對稱的切割末端，包括5'突出的粘性末端（如EcoRI：G/AATTC）、3'突出的粘性末端（如PstI：CTGCA/G）或平末端（如EcoRV：GAT/ATC）。
Type IIP限制酶一般只有一個結構域，大多數(shù)情況下以同源二聚體的形式發(fā)揮作用。酶切位點通常為4~8 bp的回文序列，這個回文序列大多數(shù)情況下是連續(xù)的，也可能在中間插入一些非特異的堿基，比如XcmI (CCANNNNN/NNNNTGG)。某些Type IIP限制酶的酶切位點里會包含部分簡并堿基，有可能切割非回文序列。無論如何，Type IIP限制酶酶切產(chǎn)物的兩個末端一定帶有酶切位點的痕跡。

圖2 Type IIP限制酶的亞基組成和切割模式

 

? Type IIS

近幾年，伴隨著Golden Gate無縫克隆技術和mRNA疫苗的發(fā)展，BsaI (GGTCTC(1/5))、BsmBI (CGTCTC(1/5))、BspQI (GCTCTTC(1/4)) 等Type IIS限制酶越來越引起大家注意。Type IIS限制酶識別特定序列，并在識別序列之外固定距離的位置切割DNA (shifted cleavage)。

Type IIS限制酶通常包含兩個結構域，或由大小兩個亞基組成，一個識別特異的DNA序列，一個負責水解磷酸二酯鍵。常用的Type IIS限制酶識別特定的非回文序列并在識別序列一側之外切割，對切割位點的序列沒有要求，因此與Type IIP不同，Type IIS酶切產(chǎn)物一個特定方向的末端可以完全不包含識別序列。這個特性決定了Type IIS限制酶在Golden Gate無縫克隆、mRNA疫苗環(huán)狀質粒模板線性化等場景中得到了廣泛應用。

圖3 Type IIS限制酶的亞基組成和切割模式

 

Type IIS還包含了所有的Type IIB、Type IIC和Type IIG亞類，因為這三個亞類的限制酶也是在識別序列之外切割DNA。

Type IIB

Type IIB限制酶的組成方式比較多樣，但都是在識別位點之外兩側 (both)固定距離的位置切割DNA，釋放一段包含識別位點的DNA短片段。Type IIB的識別位點中間往往還會包含一段非特異序列，例如BcgI ((10/12)CGANNNNNNTGC(12/10))。

圖4 Type IIB限制酶的亞基組成和切割模式

R：限制酶；M：甲基化酶；S：特異性序列識別結構域

 

Type IIC

Type IIC限制酶都是在一個蛋白中同時結合 (combine) 了限制酶和甲基化酶。部分Type IIC限制酶識別非回文序列，并在識別序列之外一側固定位置切割DNA，如MmeI (TCCRAC20/18))；另有一部分Type IIC限制酶即Type IIB亞型，識別非回文序列并在識別序列之外兩側切割，如CspCI ((10-11/12-13)CCACNNNNNTTG(12-13/10-11))。需要注意的是，Type IIC的切割位點可能出現(xiàn)1~2 bp的偏差，這可能是因為Type IIC的切割位點與識別序列之間的距離更依賴于物理距離，而非堿基數(shù)量。

圖5 Type IIC限制酶的亞基組成和切割模式
R：限制酶；M：甲基化酶；S：特異性序列識別結構域

 

Type IIG
Type IIG限制酶也是在一個蛋白中同時包含限制酶和γ (gamma) 甲基化酶，在特定識別序列（多為非回文序列）之外固定位置切割DNA，如BpuSI (GGGAC(10/14))。與Type IIC略有區(qū)別的是，Type IIG必須有SAM作為輔助因子，而部分Type IIC限制酶可以不需要SAM。
? 切刻內切酶 (Nicking Endonuclease)
絕大多數(shù)限制酶都同時切割雙鏈DNA的兩條鏈，但有少數(shù)限制酶識別特定的雙鏈序列后，只切割雙鏈DNA中的一條鏈，產(chǎn)生切刻狀 (nicking)的DNA，這些限制酶被稱為切刻內切酶。目前發(fā)現(xiàn)的天然切刻內切酶主要來自芽孢桿菌和病毒，還有一些通過對Type II限制酶進行突變改造獲得。

因為切刻內切酶只切割DNA雙鏈中的一條鏈，所以在命名方式上與普通限制酶不同，需要在正常命名的名稱之前再加上Nt或者Nb的前綴，其中第一個字母N代表Nicking，第二個字母t表示切割“上面 (top)”那條鏈（如Nt.BspD6I: 5'-GAGTCNNNN↓N-3'），b表示切割“下面 (bottom)”那條鏈（如Nb.BbvCI：3'-GGAGT↑CG-5'）。

參考文獻：
1. Loenen et al. (2014) Nucleic Acids Res, 42(1): 3-19
2. Loenen et al. (2014) Nucleic Acids Res, 42(1): 20-44
3. Pingoud et al. (2014) Nucleic Acids Res, 42(12): 7489-7527
未完待續(xù)
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