耐鹽DNase I-ST——高效去除IVT產(chǎn)物中的DNA

發(fā)布時間：2024-05-14 發(fā)布人：

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mRNA疫苗生產(chǎn)過程中，以DNA為模板通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (IVT) 獲得mRNA后，需要及時去除殘留的DNA模板，以避免后續(xù)造成不良影響。經(jīng)典策略是使用DNase I降解DNA，但常規(guī)DNase I還存在兩個問題：

（1）耐鹽性差

DNase I在含有Ca²⁺與Mg²⁺且不含其他鹽離子的緩沖液中才具有最高活性，而溶液中Na⁺濃度提高到30 mM以上就會抑制DNase I活性。體外轉(zhuǎn)錄所使用的T7 RNA聚合酶緩沖液、NTPs等原料往往含有一定濃度的Na⁺，雖然一般DNase I的用量都是遠遠超過降解DNA模板所需用量，但鹽離子仍然可能會使DNase I反應(yīng)效率不穩(wěn)定，導致降解不徹底。

（2）DNA親和力偏弱

常規(guī)DNase I與DNA的親和力偏弱，對低濃度DNA切割效率不足。隨著反應(yīng)進行，DNA濃度逐漸降低，最后剩余的DNA無法徹底清除。

針對上述問題，愚公生物通過蛋白質(zhì)理性設(shè)計改造（發(fā)明專利申請中），在野生型DNase I基礎(chǔ)上獲得了新型耐鹽DNase I-ST產(chǎn)品。DNase I-ST大幅增強了與DNA的親和力，不僅提高了鹽離子耐受性，還提升了降解低濃度DNA的效果，對于從體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中徹底去除DNA而言尤為重要。

耐鹽性好

如圖所示，與野生型相比，2U DNase I-ST在300 mM的NaCl濃度下仍能基本完全消化1 μg質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳基本無可見條帶。

DNase I-ST與野生型DNase I的耐鹽性對比

DNA降解效率高

分別使用不同廠商的IVT反應(yīng)體系（鹽濃度不同），在20 μl反應(yīng)體系中同樣以1 μg線性化質(zhì)粒DNA為模板完成體外轉(zhuǎn)錄，然后分別加入2 U DNase I（3種耐鹽型、1種野生型）在37℃處理15 min。處理后的RNA產(chǎn)物經(jīng)過柱純化回收后，使用探針法qPCR檢測DNA殘留水平。每個樣本的平均Ct與標準曲線進行比較，確定殘留DNA的量以及去除百分比。